GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)?食品微生物學(xué)檢驗?大腸菌群計數(shù)》條款7.1.3規(guī)定“樣品勻液的pH應(yīng)在6.5~7.5之間，必要時分別用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)”。
在進行酸性樣品的大腸菌群計數(shù)檢驗時，依照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)進行pH的調(diào)節(jié)。落實到樣品檢驗工作上，不知大家心中是否有下面幾點困惑。
①酸性樣品經(jīng)過稀釋之后，pH會升高至6.5~7.5嗎？
②稀釋時使用磷酸鹽緩沖液（PBS），會比生理鹽水（NS）更利于pH升高嗎？
③當(dāng)調(diào)節(jié)pH加入了堿液，如何確保樣品勻液不因被稀釋而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性？
④若不調(diào)節(jié)樣品勻液的pH，計數(shù)結(jié)果會受到影響嗎？
帶著上述幾點困惑，我們選取了橙汁、食醋和酸奶作為試驗對象，查閱相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，并進行一系列驗證實驗，期待找到滿意的答案。
查詢相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)獲知橙汁、食醋和酸奶的大腸菌群限量值，見表1。據(jù)此選取適宜的稀釋度展開實驗，橙汁選取原液，食醋選取原液和10倍稀釋樣品勻液，酸奶選取10倍稀釋樣品勻液。
測定樣品勻液的初始pH，再以1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5~7.5之間，并統(tǒng)計消耗1 mol/L NaOH的量，具體情況見表2。
三種酸性樣品的初始pH在3.6 ~4.3之間，經(jīng)PBS或NS 10倍稀釋后，pH升高幅度均不超過0.2，且兩種稀釋液間的差異也微乎其微。
調(diào)節(jié)酸奶和橙汁的pH消耗1 mol/L NaOH的量在2 mL左右，而調(diào)節(jié)食醋的pH消耗1 mol/L NaOH的量在20 mL左右。
在樣品勻液中添加適宜濃度的大腸菌群菌株稀釋液作為陽性添加，分別進行調(diào)節(jié)和不調(diào)節(jié)pH兩種處理，傾注VRBA培養(yǎng)基計數(shù)。培養(yǎng)前各取其中1皿測定培養(yǎng)基的pH，以觀察樣品勻液加入后pH的變化，標(biāo)準(zhǔn)中VRBA pH值為7.4±0.1。VRBA培養(yǎng)基pH及計數(shù)結(jié)果見表3。
將橙汁原液pH調(diào)節(jié)至6.8，傾注VRBA培養(yǎng)基，pH為7.36；不調(diào)節(jié)pH，傾注VRBA培養(yǎng)基，pH為6.5，低于7.4±0.1。本次試驗兩種處理的計數(shù)結(jié)果無明顯差異。不調(diào)pH處理的培養(yǎng)基整體呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)（類似膽酸鹽沉淀）（如圖1），但并不影響VRBA上大腸菌群菌落特征的觀察。
圖1?橙汁原液傾注VRBA生長情況
（左側(cè)為調(diào)pH處理，右側(cè)為不調(diào)pH處理）
酸奶10倍稀釋樣品勻液調(diào)節(jié)和不調(diào)節(jié)pH，傾注VRBA培養(yǎng)基，pH均在7.4±0.1范圍內(nèi)。本次試驗兩種處理的計數(shù)結(jié)果無明顯差異，培養(yǎng)基狀態(tài)無差別（見圖2）。
圖2 酸奶10倍稀釋液傾注VRBA生長情況
（左側(cè)為調(diào)pH處理，右側(cè)為不調(diào)pH處理）
食醋原液和10倍稀釋樣品勻液不調(diào)節(jié)pH，傾注VRBA培養(yǎng)基，pH分別為4.55和6.58，均低于7.4±0.1，且不調(diào)節(jié)pH的平板無菌落生長，培養(yǎng)基整體呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)（類似膽酸鹽沉淀）（如圖3）。
圖3 食醋原液傾注VRBA生長情況
（左側(cè)為調(diào)pH處理，右側(cè)為不調(diào)pH處理）
回到前文提到的幾點困惑，我們通過實驗結(jié)果來逐一解答。
?酸性樣品經(jīng)過稀釋之后，pH會升高至6.5~7.5嗎？
本試驗選取的三種酸性樣品經(jīng)過10倍稀釋后，pH僅升高0.1~0.2，未能升高至6.5~7.5。
?稀釋時使用磷酸鹽緩沖液（PBS），會比生理鹽水（NS）更利于pH升高嗎？
磷酸鹽緩沖液和生理鹽水對pH升高作用的差異微乎其微。
?當(dāng)調(diào)節(jié)pH加入了堿液，如何確保樣品勻液不因被稀釋而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性？
如調(diào)節(jié)食醋pH時加入了20 mL左右的1 mol/L NaOH，則應(yīng)在225mL稀釋液中減去相應(yīng)的體積，避免造成計數(shù)結(jié)果的誤差。
?若不調(diào)節(jié)樣品勻液的pH，計數(shù)結(jié)果會受到影響嗎？
本次試驗中橙汁和酸奶調(diào)節(jié)與不調(diào)節(jié)pH兩種處理的計數(shù)結(jié)果沒有顯著差異；而食醋調(diào)節(jié)與不調(diào)節(jié)pH兩種處理的計數(shù)結(jié)果差異顯著，不調(diào)節(jié)pH的處理平板上無菌落生長。食醋中含有醋酸、乳酸、檸檬酸等有機酸，具有廣譜抑菌作用，大腸菌群菌株在其中難以存活，樣品中甚少有檢出。
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